2° EUROPEAN WORKING GROUP ON RETT SYNDROME

Sommari laici a cura Dott.ssa Cristina Barlera

Presentiamo di seguito la sintesi degli  argomenti trattati nel  

2° European Working Group di Stresa, per ogni  sessione, nel tentativo di rendere comprensibile ad un pubblico di non addetti ai lavori i progetti di studio in corso e lo stato dell’arte della ricerca sulla sindrome di Rett. 

Prima Sessione: Meccanismi molecolari di MeCP2

(relatori: Adrian Bird, Edinburgh, UK, Yi Sun, Los Angeles, Usa, Janine LaSalle, Davis, Usa,Morteza Yazdani, Basilea, Switzerland, Cristina Cardoso, Germany, Juliette Nectoux, Paris, France).

La Prima Sessione del Meeting è stata dedicata ai meccanismi molecolari utilizzati dalla proteina MeCP2 per svolgere le sue funzioni all'interno delle cellule. La comprensione di questi meccanismi è infatti un passo essenziale per arrivare a conoscere il modo in cui la malattia si sviluppa e poter mettere a punto strategie terapeutiche.

Negli studi presentati i relatori hanno cercato di capire quale sia la reale funzione di MeCP2, o quanto meno, la sua principale funzione. Per anni si è pensato che la proteina fosse un repressore della trascrizione di altri geni che riconosce e lega perché contenenti tratti di DNA con una precisa struttura chimica (caratterizzati dalla presenza di una particolare molecola, chiamata gruppo metile). Di recente però alcuni studi hanno in parte contraddetto questa ipotesi, sostenendo che MeCP2 in realtà funziona più come attivatore dell'espressione genica, e che il suo legame col DNA non dipende in modo così esclusivo dalla “metilazione”. Dalle presentazioni e dalle discussioni di Stresa, è emerso che comunque MeCP2 agisce come regolatore della trascrizione genica: anzi, sembra dirigere l’orchestra dei geni neuronali, che nel loro insieme, durante lo sviluppo neurologico, suonano una lunga e complessa sinfonia. La proteina comanderebbe, in particolare, i momenti di silenzio che alcuni geni devono rispettare in questa “sinfonia dello sviluppo”. In sua assenza, i geni “suonano”, cioè si esprimono, senza la dovuta coordinazione spaziale e temporale. La sindrome di Rett, insomma, corrisponderebbe a una sorta di “cacofonia neuronale”, dove i geni a livello dei neuroni entrano in azione senza accordo, in tempi e sedi non opportuni. Col risultato di provocare importanti alterazioni nello sviluppo e quindi difetti nella morfologia e nella fisiologia neuronale. Difetti che nell’animale è possibile far regredire riprendendo l’espressione di MeCP2.

In questa prospettiva si è cercato poi di indagare quali geni vengano direttamente influenzati da MeCP2 e risentano maggiormente della sua assenza, e si è visto che quando la proteina non funziona, sono diversi i geni che si esprimono e probabilmente agiscono in modo anomalo. Tra di essi quello che codifica BDNF il fattore di crescita di derivazione cerebrale indispensabile per lo sviluppo e la sopravvivenza dei neuroni.

I ricercatori intervenuti hanno condotto esperimenti su cellule neuronali di topo, ma anche su cellule di pazienti affette da Sindrome di Rett, sia pure su cellule ottenute dalla pelle e non su cellule neuronali. Alcuni si sono occupati, in particolare, di mettere a punto metodi di studio basati su cellule staminali embrionali, che possano fornire “modelli” per studiare meglio in laboratorio gli effetti di MeCP2 e i meccanismi della sindrome di Rett, e di valutare gli effetti di eventuali approcci terapeutici sia in generale sulla malattia, sia sui singoli pazienti.

Seconda  Sessione: Difetti nei circuiti nervosi associati a disfunzioni di MeCP2

(relatori: David Katz, Cleveland, Usa, James Eubanks, Toronto, Canada, Mathias Dutschmann, Leeds, UK, Maurizio Giustetto, Torino, Italia)

Nella seconda sessione si è discusso dei difetti della comunicazione tra i neuroni che si associano alla carenza o all’assenza di MeCP2. Infatti, la sindrome di Rett è sì geneticamente determinata dalla mancanza di una proteina MeCP2 funzionante, ma la malattia vera e propria e il suo quadro clinico sembrano dovuti  al fatto che questa mancanza porta ad errori tanto di maturazione dei neuroni, quanto di comunicazione tra di loro. La reversibilità della malattia dimostrata due anni or sono dal professor Bird, prova tuttavia che i neuroni non muoiono e, se opportunamente curati, possono riprendere la maturazione o il corretto funzionamento. Comprendere cosa effettivamente non funziona a livello neuronale potrebbe quindi indicare la strada per nuovi importanti approcci terapeutici.

A Stresa, dalle ricerche condotte su topi è emerso che effettivamente la struttura delle cellule cerebrali è alterata dalla mancanza di una proteina MeCP2 funzionante, ma che alcune classi di cellule e alcune regioni cerebrali, sono più alterate di altre.

Per questo si è cercato di studiare più a fondo i “circuiti” neuronali, cioè i sistemi, i network di neuroni che risultano specificamente implicati in determinati processi fisiologici, come i processi cognitivi, il comportamento, la deambulazione, le funzioni vegetative (quelle funzioni vitali di base come respirazione, battito del cuore, digestione, che sono involontarie e controllate dal sistema nervoso autonomo). Circuiti che nella sindrome di Rett mostrano un ampio spettro di deficit funzionali.

I ricercatori presenti si sono focalizzati in particolare su respirazione e crisi epilettiche, perché molte bambine con sindrome di Rett soffrono di irregolarità respiratorie ed epilessia. Studiando i circuiti neuronali coinvolti nella respirazione in topi con mutazione di Mecp2 e carenza di proteina MeCP2, sono state messe in luce alterazioni che ne influenzano in modo significativo il funzionamento: si tratta di squilibri tra normali livelli di eccitazione e di inibizione, che sarebbero presenti fin dalle prime fasi dello sviluppo e si tradurrebbero in un alterato controllo del respiro e nelle ben note apnee delle bambine affette dalla malattia. Nonostante questi squilibri, tuttavia, le proprietà funzionali di questi circuiti appaiono per lo più preservate, e addirittura migliorabili attraverso la somministrazione di farmaci.

E una conferma della sostanziale integrità funzionale dei circuiti nervosi è venuta da ricerche condotte sottoponendo topi con mutazione di Mecp2 ad elettroencefalogramma: i tracciati mostrano solo lievi differenze rispetto agli animali sani, che appaiono dovute, anche in questo caso, ad alterazioni dell’equilibrio tra eccitazione e inibizione.

Gli studi presentati in questa sessione forniscono quindi le prove che nei topi in cui manca MeCP2 (affetti da una malattia del tutto simile alla sindrome di Rett), i circuiti nervosi fondamentali non presentano grosse anomalie. Identificano la natura delle alterazioni funzionali in squilibri tra eccitazione e inibizione e dimostrano che nell’animale queste alterazioni funzionali possono essere migliorate.

Terza Sessione: Geni modificatori e altri coinvolti nella Sindrome di Rett

(relatori: John Christodoulou, Sydney, Australia, Monica Justice Houston, Usa, Francesca Ariani, Siena, Italia, Saideh Rajaei, Gothenburg, Svezia, Vania Broccoli, Milano, Italia, Mario Costa, Pisa, Italia)

Nella terza sessione si è parlato di quei geni diversi da MECP2 che risultano implicati nella malattia o ne influenzano la gravità. Se infatti le mutazioni del gene MECP2 sono la causa principale, non riescono a spiegare tutto: ci sono per esempio pazienti con diagnosi clinica certa di Sindrome di Rett che non hanno mutazioni in questo gene, ed esistono varianti della malattia nelle quali il gene è coinvolto solo nel 20-40% dei casi.

Per anni si è pensato che queste varianti potessero essere causate da mutazioni in geni diversi da MECP2, e in effetti, negli ultimi tempi si è scoperto il coinvolgimento di altri due geni, CDKL5 e FOXG1: mutazioni del primo sarebbero responsabili di una significativo numero di casi della “variante di Hanefeld” della sindrome di Rett (caratterizzata da un precoce esordio delle crisi epilettiche), mentre mutazioni del secondo sarebbero alla base di alcuni casi della cosiddetta “variante congenita”.

Molto importanti per l’insorgenza della malattia e per il suo quadro clinico sarebbero però anche altri geni, i geni “modificatori”, capaci di influenzare in positivo o negativo i sintomi associati alla mutazione di un dato gene, nel nostro caso quelle di MECP2. La loro esistenza è provata, tra l’altro, dal fatto che le stesse mutazioni di MECP2 e un simile profilo di inattivazione del cromosoma X possono portare, in pazienti diversi a sintomi molto differenti: sarebbe proprio la presenza di questi geni modificatori a rendere più o meno gravi i sintomi a seconda della variante o della combinazione allelica presente nel paziente.

Uno di questi “modificatori”, potrebbe, secondo uno studio presentato a Stresa, essere il gene BDNF, un fattore neurotrofico molto importante per le funzioni neuronali: esiste infatti una variante di questo fattore, presente in un quarto circa della popolazione, che funziona meno efficacemente della variante più comune. Avere una variante piuttosto che l’altra, potrebbe influire sulla gravità di alcuni sintomi come per esempio le crisi epilettiche e forse la respirazione.

Negli Usa si sta effettuando una sorta di “screening” su topi portatori della mutazione di Mecp2, per portare alla luce questi geni “modificatori”. Con un lungo e complicato approccio genetico sono state ottenute quattro linee di topi portatori di geni che di fatto “sopprimono” alcuni effetti della mutazione di Mecp2. Riconoscere questi soppressori o modificatori e comprenderne l’azione, potrebbe aprire la strada allo sviluppo di piccole molecole capaci di simulare l’attività dei soppressori naturali e quindi di proteggere dal manifestarsi dei sintomi.

Un’altra ipotesi su cui si sta lavorando è che geni capaci di modificare il quadro clinico della sindrome di Rett siano contenuti nelle cosiddette “variazioni del numero di copie”. I geni del DNA umano sono normalmente presenti nel genoma in due copie; tuttavia, lunghi segmenti di DNA possono esser  presenti in un differente numero di copie. Ad esempio, in un certo individuo una regione di DNA potrà esser presente in una, tre o addirittura più copie, mentre in un altro questo non avviene, e sono altre le regioni di DNA duplicate o mancanti. La variabilità del numero di copie costituisce un polimorfismo della popolazione e potrebbe essere alla base di molte varianti della specie umana. Questa variabilità può coinvolgere geni e influenzare tratti fenotipici, tra cui la predisposizione alle malattie o le manifestazioni delle malattie stesse.

Un gruppo di ricercatori italiani ha analizzato il fenomeno in due sorelle affette da Sindrome di Rett, con identica mutazione in MECP2, ma sintomi molto diversi. Ha così scoperto che due geni, ritenuti bersagli di MeCP2 e indispensabili per lo sviluppo neuronale, presentano un numero diverso di copie tra le due sorelle. All’aumentato numero di copie corrisponde anche una maggiore quantità di RNA messaggero, rafforzando l’ipotesi che i due geni individuati fungano da modificatori nella sindrome di Rett.

Un’ulteriore conferma del coinvolgimento dei geni modificatori e delle variazioni del numero di copie viene dalla scoperta di duplicazioni o delezioni di geni coinvolti nel ritardo mentale in alcune bambine con una particolare variante della Sindrome di Rett a esordio precoce, prive di mutazioni nei classici geni MeCP2, CDKL5 e FOXG1.

E sul fronte degli altri geni direttamente implicati nella sindrome di Rett, a Stresa sono emerse novità riguardo a CDKL5, di cui quasi nulla si sapeva quando si è scoperto che sue mutazioni erano all’origine di alcuni casi della malattia. Oggi sappiamo che la proteina codificata si muove tra i vari compartimenti cellulari, e sembra coinvolta nella trascrizione genica, in particolare nella maturazione dei trascritti e nello “splicing”, un processo in cui è stato proposto alcuni anni fa anche il coinvolgimento di MeCP2.

Quarta Sessione: Anomalie del comportamento in topi con MECP2 mutato

(relatori: Hans Peter Lipp, Zurich, Switzerland, Giovanni Laviola, Roma, Italia, Tommaso Pizzorusso, Firenze, Italia)

La quarta sessione è stata dedicata a ricerche sul comportamento dei topi che fungono da “modello” della sindrome di Rett, cioè topi geneticamente modificati così da avere mutazioni del gene Mecp2 ed essere affetti da una malattia assimilabile alla sindrome di Rett che colpisce gli esseri umani. L’analisi del comportamento di questi animali è molto importante per conoscere meglio i geni coinvolti nella patologia, per comprendere l'esordio della malattia, i deficit funzionali a livello cerebrale, ma anche per individuare nuovi bersagli terapeutici e valutare gli effetti benefici di farmaci e trattamenti. Il comportamento è infatti il prodotto (l’output) finale del cervello, per cui la sua analisi fornisce informazioni difficilmente apprezzabili con metodi molecolari, cellulari o istologici.

Ricerche condotte su topi con MeCP2 mutata nei primi mesi di vita hanno poi messo in luce che gli animali presentano anomalie del comportamento molto più precocemente di quel che si pensava. La loro attività cerebrale appare alterata praticamente già alla nascita. In questi animali, in particolare, risulta iperattivo uno specifico sistema cerebrale che influenza il comportamento legato all’ansia. Aver individuato queste alterazioni apre la possibilità di studiare meglio l’aspetto dell’ansia e, soprattutto, di mettere a punto strategie terapeutiche.

Di interventi precoci si è occupato in modo specifico un gruppo italiano di ricercatori, provando a valutare gli effetti di una intensificazione della stimolazione “ambientale” su topi con proteina MeCP2 mutata. Da suo lavoro emerge che una precoce stimolazione ambientale degli animali - cioè la loro permanenza in gabbie “arricchite” con giochi e oggetti stimolanti fin dai primissimi giorni di vita - sembra in grado di influenzare effettivamente aspetti chiave della malattia, quali movimenti, apprendimento, memoria, ansia. Non solo: nei topi sottoposti a stimolazione ambientale precoce la morfologia dei neuroni è più simile a quella dei topi sani, e maggiori le comunicazioni tra i neuroni rispetto a topi con la stessa mutazione, ma posti in ambiente non stimolante. La permanenza in gabbie arricchite e quindi stimolanti aumenta inoltre il fattore BDNF, che nei topi privi di MeCP2 è a livelli inferiori rispetto alla norma. Tutto questo sembra dimostrare che i deficit delle funzioni cerebrali conseguenti a mutazione di MECP2 possano essere effettivamente migliorati, e getta nuova luce su come riuscire a farlo.

Quinta  Sessione: Approcci terapeutici

(relatori: Paola Conforti Milano, Italia, John Bissonnette, Portland, Usa, Laurent Villard, Marseille, France, Bruria Ben-Zeev, Israel, Cornelia Brendel, Goettingen, Germany, Bianca De Filippis, Roma, Italia, Maria Luisa Brandi, Firenze, Italia)

In questa sessione si è discusso di potenziali approcci terapeutici, cercando di far luce su possibili strategie volte a migliorare i sintomi tipici della sindrome di Rett. Mentre da un lato proseguono le ricerche per dare una soluzione genetica alla malattia, dall’altro numerosi ricercatori stanno tentando di individuare interventi farmacologici in grado di alleviarne almeno in parte i sintomi.

In apertura, si è parlato di BDNF, il fattore neurotrofico essenziale per lo sviluppo e la funzionalità del cervello, che si rivela sempre più coinvolto nella sindrome di Rett e in altre patologie neurologiche, come la malattia di Huntington. La proteina MeCP2 ne controlla la produzione: i suoi livelli sono ridotti nelle bambine malate e in topi con gene Mecp2 mutato. Inoltre, negli animali in cui manca sia BDNF sia MeCP2 i sintomi sono più gravi. Il BDNF potrebbe quindi diventare una possibilità terapeutica, ed in effetti, si è visto che in topi privi di MeCP2 un incremento “forzato” della produzione di BDNF prolunga la vita, migliora le capacità motorie e l’attività elettrica cerebrale. I ricercatori stanno perciò studiando le strategie più efficaci per aumentare i livelli del fattore senza provocare ulteriori danni: si sta esplorando la via della terapia genica, quella dell’infusione di BDNF attraverso micro pompe. Si sta cercando di vedere se l’alimentazione, l’esercizio fisico e la stimolazione cognitiva siano in grado di aumentarne la produzione. Promettente sembra in particolare una molecola, chiamata CEP-1347, che incrementa il BDNF e il suo RNA messaggero, ed è allo studio per la malattia di Huntington. Se i risultati saranno positivi potrebbe essere sperimentata anche in topi con mutazione di Mecp2.

Un altro argomento trattato in questa sessione è stato quello dei problemi respiratori: ricercatori americani stano tentando di capire meglio, studiando topi con proteina MeCP2 mutata, quali siano i processi biologici alla base delle “apnee”, cioè delle periodiche interruzioni del respiro che affliggono molte delle bambine affette dalla sindrome Rett e si riscontrano anche negli animali in cui viene ricreata la malattia. Sono stati individuati dei trattamenti che, agendo su un particolare neurotrasmettitore, il GABA, sembrano migliorare il quadro respiratorio, e potrebbero costituire un punto di partenza per affrontare uno dei grossi problemi di questa malattia.

Un gruppo di ricercatori francesi si è invece posto l’obiettivo di cercare, tra quelli esistenti, farmaci capaci di dare risposte concrete alle bambine malate alle loro famiglie. Il loro ambizioso progetto, finanziato tra gli altri dalla Agence Nationale de la Reserche, è iniziato proprio quest’anno, e prevede lo screening di centinaia di composti farmacologici che agiscono sul metabolismo, la sintesi e la biodisponibilità di neurotrasmettitori o altri fattori nervosi e neurotrofici: quelli più promettenti, sulla base degli effetti molecolari e cellulari, verranno testati in vivo su topi malati. La speranza è che entro il 2012 possano emergere una o più molecole con le quali poter avviare sperimentazioni cliniche su piccole pazienti affette da sindrome di Rett.

Da Israele sono giunte poi notizie dei primi tentativi con il glatiramer acetato, un farmaco utilizzato da tempo nel trattamento della sclerosi multipla e dotato di effetti neuroprotettivi. Aumenterebbe i livelli di BDNF agendo su alcune cellule immunitarie, ridurrebbe il danno neuronale e favorirebbe la neurogenesi - cioè la proliferazione e la maturazione di cellule progenitrici di neuroni. I risultati preliminari indicano che negli animali il farmaco, iniettato quotidianamente sottocute, aumenta effettivamente BDNF in alcune regioni cerebrali, ma non appaiono del tutto convincenti. Gli effetti di glatiramer dovranno perciò essere confermati in condizioni sperimentali diverse e si dovrà verificare se l’incremento del fattore BDNF e l’azione neuroprotettiva si riflettano positivamente a livello di sintomi.

Su un'altra classe di farmaci, quella degli antibiotici aminoglicosidici, hanno invece indagato alcuni ricercatori tedeschi. Si è visto infatti che in alcune malattie genetiche gli aminoglicosidi riescono in qualche modo a bypassare le mutazioni “non senso”, portando a una  parziale sintesi della proteina completa, e sappiamo che un terzo delle mutazioni del gene MECP2 è costituito proprio da una mutazione di questo tipo (che ha come risultato una proteina MeCP2 più corta e non funzionante). Gli effetti di alcuni di questi composti su cellule nervose con mutazione “non-senso” di MECP2 appaiono interessanti: ad esempio, un antibiotico molto comune, la gentamicina, fa sì che il gene difettoso venga parzialmente letto e tradotto, e altri composti in fase di studio sembrano ancora più efficaci. Se questa possibilità di bypassare anche solo parzialmente la mutazione venisse confermata, si potrebbero sviluppare aminoglicosidici ad hoc, per avere una maggiore efficacia e ridurre gli effetti collaterali.

Ci si è occupati anche di un aspetto poco studiato della sindrome di Rett, il deficit del sistema colinergico, cioè del network di neuroni che per comunicare utilizzano il neurotrasmettitore acetilcolina. Si è visto che effettivamente, nei topi con mutazione della proteina MeCP2, il sistema è alterato: ma la somministrazione di colina (una vitamina del complesso B precursore dell’acetilcolina), sembra poter ridurre almeno in parte questo deficit: la sostanza, data a partire dalla nascita attenua alcune delle anomalie neurobiologiche e alcuni dei disturbi motori, aumentando la produzione di BDNF. Una volta chiarito se anche le bambine malate soffrano in modo significativo di questo deficit, la somministrazione precoce di colina potrebbe diventare una interessante strategia terapeutica.

In conclusione della sessione, si è parlato di un tema molto interessante e sentito: i problemi ossei.  Nelle bambine affette da sindrome di Rett è infatti elevata l’incidenza di scoliosi e osteoporosi e sono frequenti le fratture da fragilità ossea. E la loro portata è tale che non possono essere attribuite alla sola immobilità. Dai pochi studi condotti in proposito, sembra esistano effettivamente alterazioni molecolari della fisiologia ossea: i ricercatori si sono perciò chiesti se i problemi a livello scheletrico non siano più direttamente dovuti alla mutazione di MeCP2 e al suo malfunzionamento. Occorrerà quindi studiare urgentemente con ricerche ad hoc il tipo di alterazione che interessa il tessuto osseo: una volta chiariti i meccanismi di questo deficit delle ossa, si potrebbe intervenire subito per prevenirlo, perché attualmente disponiamo di parecchi farmaci per curare osteoporosi e altri tipi di perdita ossea, che agiscono con varie modalità d’azione.

Sesta Sessione: Aspetti clinici nella sindrome di Rett e relativi disordini.

(relatori: Thierry Bienvenu e Nadia Bahi-Buisson, Paris, France, Christa Einspieler, Graz, Austria, Alessandra Murgia, Padova, Italia, Silvia Russo, Milano, Italia)

La sesta e ultima sessione, voluta per far da ponte tra genitori e ricercatori, ha affrontando tematiche di maggiore interesse per la vita "quotidiana" delle famiglie, e le relazioni sono state tradotte in simultanea per i genitori presenti.

Dopo il saluto della presidente di proRETT, della rappresentante di EuroRETT, e della dottoressa Lucia Monaco, Direttore dell’Ufficio Scientifico di Telethon, i lavori sono stati aperti due ricercatori francesi che hanno fatto il punto delle conoscenze, cliniche genetiche e molecolari della malattia: sono stati riassunti i sintomi più comunemente associati ai 3 geni che ad oggi sappiamo causare la Rett e ci si è soffermati sulle correlazioni tra genotipo e fenotipo, cercando di capire se in base al gene mutato e al tipo di mutazione sia possibile prevedere la gravità dei sintomi. Questi studi dovrebbero accrescere la comprensione di tutti i quadri sintomatologici che si associano alle mutazioni di questi geni, così da accelerare la diagnosi sia clinica che molecolare.

A seguire l’intervento di un gruppo austriaco, che ha analizzato ecografie e home-video dei primissimi giorni di vita di bambine che poi hanno sviluppato la sindrome di Rett. Stando ai dati da loro raccolti, la malattia sarebbe già presente subito dopo la nascita, pur se in modo impercettibile (rigidità, movimenti a scatti, scarsa varietà di movimenti) e non facilmente individuabile.

Si è parlato poi di sintomatologia epilettica associata alle mutazioni di CDKL5 e MECP2. Ricercatori italiani hanno studiato l’assetto dei due geni in 38 bambine con epilessia insorta nel primo anno di vita, scoprendo come mutazioni del gene CDKL5 si associno a crisi epilettiche precoci molto più spesso rispetto alle mutazioni di MECP2. Questi risultati preliminari sembrano suggerire che CDKL5 - al contrario di MECP2 - abbia un ruolo rilevante nella patogenesi di condizioni morbose caratterizzate da crisi epilettiche a esordio precoce, nei primi mesi di vita.

Quindi, alcuni tra i principali relatori intervenuti nelle altre sessioni si sono succeduti per riepilogare in modo semplificato alle famiglie presenti quanto era stato presentato e discusso in precedenza. Un gruppo di clinici, provenienti da tutto il mondo, si è poi messo a disposizione dei genitori rispondendo con attenzione e competenza alle loro domande sulla sintomatologia e la vita quotidiana delle bambine malate.